Objectives

本研究首次對源自相同 anti-human TIGIT Nanobody (Nb) 的 Nb 和 minibody-like 格式（稱為 'Minabody', Mnb）進行了 Positron Emission Tomography (PET) 成像的臨床前直接比較。

研究證明，64Cu 標記的 Nb PET 追蹤劑表現優於 64Cu 標記的 Mnb 格式，在小鼠模型中顯示出更快、更具特異性的腫瘤靶向和較低的背景信號。
研究比較了三種 PET 放射性核種（Copper-64 (64Cu)、Gallium-68 (68Ga)、Fluorine-18 (18F)）用於 Nb 成像，結論是 64Cu 為臨床前 Nb 成像提供了更優越的腫瘤攝取和影像對比度/解析度。

Methodology

本研究採用了蛋白質工程和放射化學方法：

將一個 anti-hTIGIT Nb 重組為雙價的 Mnb (Nb-CH3 fusion, 約 55.7 kDa)。
Nb 和 Mnb 都通過離胺酸殘基與螯合劑 p-SCN-Bn-NOTA (NOTA) 進行了共軛。
使用 Surface Plasmon Resonance (SPR) 針對重組 hTIGIT 蛋白，以及使用流式細胞儀針對表達 hTIGIT 的 TC-1 細胞，測定了體外結合親和力 (KD)。
放射性標記：Nb 和 Mnb 通過 NOTA 螯合作用標記 64Cu。Nb 還標記了 68Ga（通過 NOTA）和 18F（使用輔基 N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate, [18F]SFB）。
通過 radio-SEC 和 radio-iTLC 評估放射化學純度 (RCP)。在人類血清中和通過 EDTA 挑戰測試了穩定性。
放射性配體結合測定確認了標記後的結合能力。
體內評估：在帶有 hTIGIT 陽性和 TIGIT 陰性 TC-1 腫瘤的免疫缺陷小鼠中，於注射後不同時間點進行了 PET/CT 成像和離體生物分佈研究。
統計分析：使用非配對 t-test 和 One-way ANOVA 來確定顯著性。

結合親和力：Mnb 顯示出比 Nb 更高的親和力（蛋白質 KD=0.33 nM，細胞 KD=0.31 nM），可能歸因於親合力效應。 NOTA 共軛和放射性標記並未顯著損害結合能力（例如，[64Cu]Cu-NOTA-Nb 蛋白質 KD=1.32 nM，[64Cu]Cu-NOTA-Mnb 蛋白質 KD=0.65 nM）。
體內 Nb vs. Mnb (64Cu)：[64Cu]Cu-NOTA-Nb 從注射後 (p.i.) 1 小時起即在 hTIGIT+ 腫瘤中顯示特異性攝取，可持續長達 48 小時。 [64Cu]Cu-NOTA-Mnb 僅從 8 小時 p.i. 開始顯示特異性攝取，初始血液池信號高且肝臟攝取顯著。 Nb 達到了更高的目標與背景比；Nb 在 8 小時的 hTIGIT+ 腫瘤與陰性腫瘤比值峰值為 11.45±0.99，而 Mnb 在 48 小時為 1.75±0.16。Nb 在 8 小時的腫瘤與血液比值峰值為 23.05±4.22，而 Mnb 在 48 小時為 13.89±1.04。
Nb 的放射性核種比較（1 小時 p.i.）：所有追蹤劑均顯示特異性 hTIGIT+ 腫瘤攝取。[64Cu]Cu-NOTA-Nb 顯示最高的攝取量（3.26±0.15 %IA/g）和最佳影像解析度。[68Ga]Ga-NOTA-Nb 具有相當的攝取量（3.13±1.29 %IA/g），但解析度較低。[18F]FB-hTIGIT-Nb 攝取量較低（1.68±0.13 %IA/g），但解析度優於 68Ga。 18F-Nb 的腎臟滯留量（80.60±17.51 %IA/g）低於 64Cu-Nb（118.07±19.84 %IA/g）和 68Ga-Nb（166.99±14.89 %IA/g）。

這項研究通過直接比較 Nb 和 Mnb 格式進行 PET 成像，提供了先前缺乏的寶貴見解。

限制：使用過度表現的腫瘤模型 (TC-1 hTIGIT) 可能無法完全代表在臨床情境中對內源性、可能低水平 TIGIT 表現進行成像的挑戰。在低抗原密度環境下，Nb 的優越性能可能不那麼顯著，或者 Mnb 的親合力優勢可能變得更為重要。
不明確的 Mnb 非目標攝取：[64Cu]Cu-NOTA-Mnb 在 TIGIT 陰性腫瘤和肝臟中的顯著攝取值得進一步研究。雖然作者提出在其他 minibody 研究中觀察到的放射性核種依賴效應，並排除了 CH3 二聚體與 FcRn 結合的可能性，但確切機制仍不清楚，這限制了 Mnb 格式的實用性。為 Mnb 探索不同的螯合劑或放射性核種（如文中所述的 124I）可能有助於釐清這一點。
替代格式：研究雙價 Nb 格式（約 30 kDa）可能提供有用的資訊，有潛力將 Mnb 的親合力優勢與 Nb 更有利的藥物動力學和較低的非目標結合相結合。
放射性核種選擇：支持 64Cu 用於 Nb 成像的結論，得到了臨床前數據（解析度、攝取、成像窗口）的充分支持。然而，對於臨床轉化，應承認 64Cu（可用性、成本）相較於 68Ga（發生器）和 18F（廣泛的迴旋加速器生產）的實際限制。使用 [18F]SFB 標記的 Nb 攝取較低，這可能需要探索替代的 18F 標記策略，如 Al18F-RESCA，儘管可能存在產率/純度的權衡，以確認觀察結果是否依賴於方法。